دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی جندی شاپور اهواز دانشكده داروسازی پايان نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد سم شناسی عنوان :

Transcript

1 I

2

3 بررسی اثر عصاره هیدروالکلی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی جندی شاپور اهواز دانشكده داروسازی پايان نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد سم شناسی عنوان : گیاه Capparis spinosa و Teucrium polium بر آنزیم sirt3 میتوکندری رده سلولی سرطان کولون انسانی )HT29( محل انجام پژوهش: مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی نگارنده: فروزان خدایی اساتید راهنما : دکتر محسن رضایی دکتر محمود هاشمی تبار اساتید مشاور : دکتر هیبت اهلل کالنتری دکتر امیر سیاهپوش شماره ثبت پایاننامه : 888 تاریخ ثبت پایاننامه: 1931/8/5 تاریخ دفاع پایان نامه : 1939/11/8 هزینهی این پایاننامه از محل اعتبار طرح تحقیقاتی مصوب شماره CMRC-78 تأمین شده است و کلیهی حقوق این پایاننامه برای معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی جندیشاپور اهواز محفوظ است.

4

5 تقد ي م هب دو مهربان ستودني پدر و ماردم رپوردگارا: هن ميتوا ن م مواهيشان را هك رد راه زعت من سفيد شده سياه كن م و هن رباي دستاهي پينه بسته شان هك ثمره تالش رباي اتخاار من است ره مي ي دارم پ س تو فيق م ده هك ره لحظه شكر گزارشان با ش م و اثنيهاهي عمرم را رد عصاي دست بودنشان بگذرا ن م و تقد ي م هب ربا ردا ن م هك دعاي خيرشان بدرهقي را ه م بود

6 سپاسگزاري مح س ن رضایي هك با كرا مت ي چون خورشيد ف ر لم الوق ل م يشكر الاالق«بس ي شايسته است از استاد هيخته و فرزاهن جناب آاقي دكتر هب مصدا ق «من ل م يشكر ا سرزمين دل را رو شن ي بخشيدند و گلش ن سراي عل م و دا ن ش را با راهنمایياهیي كارساز و سازنده بارور ساختند تقدري و تشكر نما ي م مح م ود اه شي ي تبار و استاد ان مشاور دكتر كالنتري و دكتر سياهپوش بااطه راهنمایياهي بي رديغشان رد ربشيپد پايان انهم ممچنين از استاد راهنماي دوم دكتر سپاسگزارم ني يتوا ن م معنایي باالرت از تقدري و تشكر رب زبا ن م جاري سازم و سپاس خود را رد وصف استادان خو ي ش آش كار نما ي م هك ره هچ گو ي م و سرا ي م ك م گفتهاهم

7 چكیده: مقدمه: دو بیماری سرطان و دیابت بیماریهای میتوکندریایی هستند که در جامعه امروزی شیوع صعودی را طی میکنند از آنجایی که در مطالعات اخیر نشان داده شده که این دو بیماری با آنزیم Sirt3 در ارتباط می باشند در این مطالعه اثرات عصاره متانولی کلپوره و لگجی که در طب سنتی برای درمان هر دو بیماری استفاده میشود را بر میزان ROS و فعالیت آنزیم Sirt3 در سلول های سرطان کولون روده بزرگ رده سلولی HT-29 را مورد بررسی قرار دادیم. روش کار: ابتدا مقدار IC50 گیاهان با روش MTT بدست آمد سپس اثر آنها را در غلظت بدست آمده از IC50 بر تولید ROS و فعالیت آنزیم Sirt3 مورد بررسی قرار دادیم. برای اندازه گیری میزان ROS تولیدی از DCF استفاده شد. پس از تخلیص میتوکندری برای بررسی فعالیت آنزیم از کیت شرکت Bioscience استفاده شد. نتايج: مقدار IC50 دو گیاه با یکدیگر متفاوت بود.مقدار IC50 برای کلپوره 3µg/ml در زمان 88 ساعت و برای لگجی 1.7µg/ml در زمان 27 ساعت بدست آمد. نتایج ROS سلول های تحت مواجهه با عصاره کلپوره و لگجی نشان داد عصاره لگجی در زمان 6 ساعته میزان ROS بیشتری نسبت به کلپوره تولید میکند اما در زمان 17 ساعت میزان ROSتولیدی کلپوره بیشتر از لگجی می باشد. نتایج حاصل از میزان فعالیت Sirt3 نشان داد که اثر عصاره ها بر روی این آنزیم نشان دهنده افزایش فعالیت آنزیم سلول های HT-29 تحت مواجهه با عصاره لگجی و کلپوره می باشد. نتیجه گیری: نتایج مطالعه نشان میدهد که گیاه لگجی و کلپوره با توجه به سابقه طوالنی در مصرف بعنوان ضد دیابت و ضد سرطان می توانند موجب افزایش ROS و بدنبال آن افزایش فعالیت Sirt3 میشود. به نظر میرسد تغییر در فعالیت Sirt3 میتواند نقش مهمی در اثرات این گیاه داشته باشد. Sit3 احتماال یک نقطه مشترک در دو بیماری سرطان و دیابت می باشد. واژگان کلیدی:گیاه لگچی گیاه کلپوره میتوکندری آنزیم Sirt3

8 فهرست مطالب الف- ب- بیان کلیات مساله ب- 1. سرطان کولون... 6 ب- 7. ژن ه یا تعدیل کننده... 8 ب- 9. میتوکندری... 8 ب خصوصیات ظاهری میتوکندری و تغییرات آن ها... 9 ب غشا میتوکندری... 9 ب فضای بین دو غشا... 9 ب :غشا داخلی میتوکندری... 9 ب :ماتریکس میتوکندری...11 ب- 8. محل میتوکندری ها و تعداد آن ها در سلول و منشا میتوکندری...11 ب محل میتوکندری ها در سلول...11 ب تعداد میتوکندری ها در سلول...11 ب منشأ میتوکندری...11 ب- 5. نقش ه یا زیس یت میتوکندری...11 ب تنفس هوازی سلول ها...11 ب اکسیداسیون اسیدهای چرب...11 ب چرخه ی اوره...11 ب بیوسنتز هم...11 ب بیوسنتز یوبیکینون وQ ب سنتزFe-S...11 ب ذخیره و تجمع مواد در میتوکندری ها...11 ب اندامهای درگیر و اختالالت عمومی آن ها در بیماریهای ژنتیکی میتوکندریایی...11 ب چاقی...11 ب اختالالت عصبی ب رادیکال های آزاد آسیب های اکسیداتیو و سالمندی...11 I

9 ب- 2. ب- 6. مرگ سلولی نکروزی و آپوپتوز...11 پروتئین Sirt3 ب خانواده 11...:sirtuin ب- 8. اهمیت گیاهان دارویی ب گیاه لگجی...18 ب تیره کور )کبر ( Capparidaceae :...18 ب گیاه شناسی ب ترکیبات شیمیایی...19 ب اندام مورد استفاده...19 ب ریشه کبار...19 ب پراکندگی جغرافیایی...19 ب پراکندگی در ایران...19 ب مصارف دارویی و صنعتی کبار...11 ب خواص درمانی...11 ب- 3 گیاه کلپوره ب اجزای متشکله...11 ج- بررسي متون...11 Literature Review د- اهداف و فرضيات HYPOTHESIS( )OBJECTIVES &...11 د- 1. هدف د- 7. اهداف د- 9. اهداف اصلی طرح Objective( )General ویژه طرح Objectives( )Specific کاربردی...12 د- 8. فرضیات یا سؤاالت پژوهش فصل دوم: مواد و روش ها...16 الف- مواد الزم و دستگاه ها...18 ب-کشت سلول...11 ب- 1 - تهیه محیط کشت و محلول ها...11 ب تهیه محیط کشت سلولیDMEM...11 ب بافر شستشوی...11 PBS ب آماده سازی سرم( FBS )...11 II

10 ب- 7 - کشت سلول ب دفریز کردن سلول ها...11 ها...11 ج- تهیه عصاره متانولی گیاهان د- آماده سازی داروها و دارودهی...11 با تریپان بلو HT29 ب پاساژ دادن سلول ب فریز کردن سلول ها...11 د -1- آماده سازی عصاره متانولی گیاهان لگجی) spinosa )Capparis وکلپوره) polium )Teucrium...11 د - 7- سنجش توان زیس یت د -9- دارو دهی به سلول ه یا د- 8. روش سنجش...12 MTT د رنگ د کاربردهای آمیزی MTT تست MTT د مزایای تست...13 MTT د تست MTT برای سلول ه یا مونوالیر یا 13...:Attached د روش تهیه منحنی استاندارد...18 د- 5. میزان ROS تولید شده...19 د- 6. جداسازی میتوکندری...11 د- 2. روش اندازه گیری...11 Sirt3 د- 8. آنالیز آماری...11 د- جداول...12 جدول متغیرها:...12 ه- مالحظات اخالقی...16 الف. بحث...23 ب. نتیجه گیری...21 پیشنهادات فصل پنجم:منابع...21 III

11 IV

12 1 فصل اول بیان مسئله

13 1 الف- بیان مساله سرطان روده بزرگ بیماری است که در آن سلول های بدخیم )سرطانی( در بافت روده بزرگ تشکیل می شوند) 1 (. سرطان روده بزرگ سومین سرطان شایع است و چهارمین سرطان مرگ زا در کشورهای شرقی است) 7 (. شیوع این سرطان در گروه های نژادی مختلف متفاوت است و هم چنین شیوع آن با سن رژیم غذایی سابقه خانوادگی افراد سیگار کشیدن مصرف الکل کم تحرکی و چا قی از عوامل مستعد کننده آن میباشند. پلی مورفیسم های ژنتیکی همچنین در گسترش بدخیمی های روده ی بزرگ نقش بسز ایی دارند. یکی از مسیرهایی که پلی مورفیسم ژن های دخیل در آن با سرطان روده ی بزرگ مرتبط است مسیر سیگنالینگ انسو لین میباشد که مطالعات گوناگون نشان داده اند کسانی که سطح انسولین آنها بیشتر از افراد سالم است بیشتر در معرض ابتال به سرطان های مختلف مانند سرطان روده بزرگ قرار دارند) 9 و 1 (.اخیرا در تحقیقی که در سال 7117 صورت گرفته نشان داده اند که هیپرانسولینمی عامل اصلی ارتباط بین دیابت و سرطان می باشد) 8 ( و عالوه بر آن یکی از مهمترین ارگانل های ارتباط بین این دو بیماری میتوکندری می باشد. مدارکی وجود دارد که اختالل در عملکرد میتوکندری در دیابت پیری اختالالت عصبی و سرطان نقش کلیدی دارد) 5 (. امروزه تغییرات اساسی که در فیزیولوژی سلول ممکن است اتفاق افتاده و به دنبال آن سلول وارد مراحل سرطانی شود مشخص گردیده است. یکی از این تغییرات گریز سلول از مرگ برنامه ریزی شده (Apoptosis) می باشدکه با توجه به نقش اصلی و اساسی که میتوکندری ها در این مورد ایفا می کنند تحقیقات وسیع و گسترده ای انجام شده است) 6 و 2 (. برای اولین بار Otto Warburg در سال 1376 بیان نمود که سلول های سرطانی بیشترین میزان ATP مورد نیاز خود را از طریق گلیکولیز و در شرایط هوازی تامین می کنند. این حالت گلیکولیز در حضور اکسیژن که به ))اثر واربرگ(( معروف است یکی از مشخصه های سلول های سرطانی بوده که در اکثر آزمایشگاه ها مورد تایید قرار گرفته است. آقای واربرگ چنین پنداشت که گلیکولیز هوازی یک خصوصیت و ویژگی است که در سلول های سرطانی دیده شده و ناشی از اشکال در تنفس سلولی است. لذا عنوان کرد که سرطان می تواند به واسطه معیوب شدن متابولیسم میتوکندریایی باشد )8(. لذا در مطالعات گذشته تصور بر این بود که چنانچه گلیگولیز در سلول های سرطانی مهار گردد سلول قادر به فعال کردن سیستم فسفریالسیون-اکسیداتیو نیست و این موضوع می تواند به عنوان نشانه ای از عدم کارآیی میتوکندری در این سلول ها باشد )3( ولی در مطالعات بعدی مشخص گردیدکه میتوکندری های سلول های سرطانی دارای فعالیت و کارآیی نسبتا خوبی همراه با توانایی تنفس و تولید ATP ارائه یک تناسب فسفوریالسیون-اکسیداتیو طبیعی و نیز توانایی عادی در اکسیداسیون سوبستراهای تنفسی هستند) 11 (.

14 1 تجمع ( Reactive oxygen species) ROS یکی از فاکتورهای مهم در موارد اختالل عملکرد میتوکندریایی است. ROS به دلیل توانایی که در افزایش تکثیر و مهاجرت سلولی و نیز القای ضایعات میتوکندریایی که می تواند شروع کننده سرطان زایی و تداوم سیر تصاعدی سرطان باشد به عنوان یک عامل ایجاد کننده سرطان شناخته شده است )11(. بیشترین میزان ROS تولید شده در زمان تنفس میتوکندریایی ایجاد می گردد. در زنجیره انتقال الکترون میتوکندری مراکز redox متعددی وجود دارد که موجب نشت الکترون می شود و با اکسیژن مولکولی ترکیب می گردد. این مولکولهای ایجاد شده به عنوان منبع اصلی تامین سوپراکسید تولید شده در اکثر بافت های بدن می باشد. ROS تولید شده اگر سم زدایی نشود پروتئین چربی اسیدهای نوکلئیک درون سلولی را اکسیده کرده و در نهایت موجب عدم کارایی و مرگ سلولی می گردد. فعالیت های مضر ROS توسط آبشاری از آنزیم های آنتی اکسیدان و یا مواد آنتی اکسیدان محلول در آب و چربی مهار می گردد. در استرس اکسیداتیو میزان ROS تولید شده بیش از عوامل دفاعی آنتی اکسیدانی بوده وموجب بیماری هایی از جمله سرطان می گردد) 17 (. وابستگی فزاینده ی سلول های سرطانی به گلیکولیز جهت تامین ATP مورد نیاز می تواند به عنوان یک نقطه ی هدف در جهت در مان سرطان مورد توجه قرار گیرد. مطالعات انجام شده نشان می دهد که تغییر در متابولیسم سلول نقش کلیدی در ایجاد و گسترش سرطان دارد. تعدادی از تغییرات متابولیک می توانند تغییراتی را در فعالیت انکوژنها یا سرکوبگران تومور انجام دهد و موجب از بین رفتن این عوامل شوند و در ایجاد سرطان نقش داشته باشند) 19 (. از طرف دیگر طبق بررسی ها فعالیت اکسیداتیو میتوکندریایی می تواند در زمینه خطر ابتال به دیابت به عنوان یک عامل مهم در نظر گرفته شود )18(. Sirt3 یکی از پروتئین های sirtuinsدر میتوکندری است. Sirtuins از جمله مهمترین پروتئین های میتوکندری هستند که در استیالسیون و داستیالسیون نقش دارند و این پروتئین های sirtuins در پیری مقاومت به استرس و متابولیت نقش تنظیمی دارند. عملکرد Sirt3 sirtuins می باشند. در بین خانواده شامل هفت نوع sirt7 sirt6 sirt5 sirt4 Sirt3 sirt2 sirt1 sirtuins به طور ویژه با عملکردهای میتوکندری در ارتباط است زیرا موقعیت آن در ماتریکس میتوکندری می باشد. Sirt3 به میزان باالیی در کلیه کبد قلب مغز و بافت چربی قهوه ای و نیز بافت هایی که در سوخت و ساز نقش فعال دارند بیان میشود )5(. پشنهاد شده است که Sirt3 نقش مهمی در هموستاز انرژی دارد و نیز تنظیم کننده تولید ATP در بافتهای مختلف است. اخیرا نشان داده شده است که Sirt3 نقش های مهمی در متابولیسم لیپید کبد نیز دارد و نیز این پروتئین در عملکردهای

15 1 میتوکندری مانند متابولیسم اکسیداتیو و نیز استرس اکسیداتیو نقش دارد همچنین این پروتئین در پیری و آسیب به سلول نیز نقش ایفا می کند) 15 (. Sirt3 در مطالعات انجام شده 7111 در سال نشان داده شده که میزان در ماهیچه اسکلتی موش های دیابتی به میزان 51 %کاهش داشته است. کاهش فعالیتSirt3 در اختالالت متابولیک در دیابت نقش دارد. این مطالعه پیشنهاد می کند که Sirt3 در متابولیسم ماهیچه اسکلتی در حالت عادی و دیابت نقش مهمی دارد.در دیابت نوع 1 و 7 با کاهش فعالیت Sirt3 میزان استرس اکسیداتیو و فعالیت JUNK افزایش می یابد که در نتیجه این تغییرات منجر به اختالل در ترشح انسولین میشود. تحقیقات نشان می دهد که ارتباط بین Sirt3 و تولید ROS در شرایط پاتولوژیک و فیزیولوژیک متفاوت با HIF1-α 1 و SOD 7 در ارتباط می باشند که اینها نیز در تشکیل تومور نقش دارند )15( و نیز Sirt3 به عنوان سرکوب کننده تومور از طریق توانایی این پروتئین در سرکوب گونه های فعال اکسیژن (ROS) و HIF-1α می باشد که این دو عامل نقش اصلی را در ایجاد تومور دارند ) 19 و 77 (. Sirt3 در آپوپتوز و کنترل رشد سلولی نیز نقش دارد و یک تنظیم کننده عملکردهای سلولی Allison و همکارانش در شرایط بدون استرس در سرطان آندوتلیال است )16(. در مطالعات انجام شده بوسیله.J Simon پروتئین Sirt3 در آپوپتوز القا شده بوسیله BCL-2 نقش دارد )12(. در مطالعات نشان داده شده که حذف ژنتیکی داستیالز میتوکندری Sirt3 منجر به افزایش سوپراکسید میتوکندری می شود که منجر به گسترش تومور می گردد) 18 (. همچنین در بررسی صورت گرفته بوسیله SiDe Li در سال 7111 نشان داده شده است که عملکرد ژن کد کننده Sirt3 در سلول تنظیم برنامه های رونویسی در پاسخ به استرس خارج سلولی و داخل سلولی است که جهت توقف چرخه سلولی آپوپتوز و پیری سلول است. Sirt3 در فعالیت p53 نیز نقش دارد که p53 در پیری و رشد سلول نقش مهمی را ایفا میکند) 16 (. مطالعات نشان داده اند که با افزایش تمرین های ورزشی میزان بیان Sirt3 افزایش میابد عالوه بر این نشان داده شده است که بیان Sirt3 در ماهیچه اسکلتی به رژیم غذایی حساس است به طوری که بیان Sirt3 در ناشتا و محدودیت کالری افزایش می یابد و با رژیم غذایی پرچرب بیان آن کاهش میابد )15( و تنظیم تولید کتون بدن در روزه داری را بر عهده دارد و دارای نقش تنظیمی در این مورد می باشد )13(. Sirt3 در عملکردهای میتوکندری و نیز در انطباق ترموژنز بافت چربی قهوه ای نیز نقش مهمی را ایفا می کند )71( و نیز در مطالعات نشان داده شده که پروتئین Sirt3 در ارتباط با طول عمر انسان می باشد )71(. 1 Hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) 2 Superoxide dismutase

16 2 به طور کلی کاهش میزان Sirt3 در بسیاری از مطالعات موجب باال رفتن ROS گزارش شده است از طرفی در سرطان در بسیاری از مطالعات نشان داده شده است که میتوکندری از چرخه تولید انرژی (ATP) خارج می گردد و یک گلیکولیز هوازی اتفاق می افتد) 77 (. در نتیجه میزان تولید ROS ناشی از میتوکندری کم می شود این موضوع می تواند به Sirt3 ارتباط داشته باشد. بنابراین به نظر میرسد که در درمان دیابت و داروهای سنتی مورد استفاده تغییراتی درSirt3 قابل پیش بینی باشد که می توان همین تغییرات را در سلول های سرطان نیز جستجو نمود. گیاهانی که در طول تاریخ مورد استفاده در هر دو بیماری بوده اند می توانند کاندیداهای مناسبی جهت بررسی میزان Sirt3 باشند. ما در بررسی هایی که تعیین گیاهان مورد استفاده در هر دو بیماری انجام داده ایم 7 گیاه را انتخاب نموده ایم که در هر دو بیماری مورد استفاده بوده اند. این گیاهان شامل لگجی) spinosa )Capparis وکلپوره) polium )Teucrium می باشد. مطالعات صورت گرفته بوسیله Tea Kulisic-Bilusic و همکارانش در 7117 در این زمینه نشان میدهد که برگ و گل گیاه لگجی در پیشگیری از سرطان روده بزرگ رده سلولیHT-29 مفید میباشد) 79 ( و نیز در مطالعات صورت گرفته نشان داده شده است که عصاره میوه گیاه لگجی در دیابت نوع 1 و 7 سبب کاهش قند خون و چربی خون می شود ) 78 و 75 (. گیاه کلپوره دارای خاصیت ضد سرطانی در سرطان کبد انسان رده سلولی Hep G2 می باشد و در درمان آن نقش دارد )76(. همچنین عصاره گیاه کلپوره در سرطان پروستات موجب توقف تکثیر سلولی می شود و در درمان سرطان پروستات نقش دارد) 72 (. و نیز در بررسی های صورت گرفته نشان داده شده که گیاه کلپوره در درمان دیابت نوع 7 مفید می باشد ) 76 و 72 و 78 (. گیاه لگجی spinosa( )Capparis متعلق به خانواده کاپاریداسه در نواحی مختلف ایران از جمله دامنه های البرز بلوچستان شیراز کازرون و نورآباد ممسنی می روید.قسمت های مورد استفاده گیاه جوانه ها ی تکمه های مولد گل است که در سرکه یا آب شور قرار داده می شود و مصرف می گردد.میوه ریشه و پوست آن بیشتر به مصرف درمانی می رسد.در طب سنتی از این گیاه به عنوان داروی درمان نقرس مدر روماتیسم بیماری های عصبی و امراض کبد ی استفاده شده است )78(. پژوهش های انجام شده نشان می دهندکه گیاه لگجی دارای اثرات ضد درد ی ضد التهابی آنتی اکسیدانی و فیتوپروتکتیو آنتی هپاتوتوکسیک اثرات محافظتی روی کندروسایت ها اثرات هیپولیپدمیک و هم چنین اثرات آنتی آلرژیک آنتی هیستامینیک و آنتی لیشمانیا می باشد ) 76 و 72 (. در مراکش به طور سنتی از گیاه لگجی برای درمان و کنترل دیابت استفاده شده است) 78 (.یانیو و همکاران در 1382 نشان داده اند که لگجی یکی از گیاهان مورداستفاده در درمان د یابت بوده است) 73 (.

17 6 کلپوره یا مریم نخودی Polium) (Teucrium از تیره نعناع (Labiatae) گیاهی است علفی cm دارای به ارتفاع ظاهر سفید پنبه ای که معموال در نواحی سنگالخی و ماسه زارهای نواحی مختلف اروپا منطقه مدیترانه شمال آفریقا و جنوب غرب آسیا از جمله ایران در نواحی مختلف شمال غرب جنوب و مرکز ایران و کوهستانهای نیمه خشک پراکندگی دارد) 91 (. مصرف دارویی آن به زمان بقراط و جالینوس بر می گردد و بخش دارویی آن که سر شاخه های گلدار آن می باشد اثر مقوی و ضد تشنج داشته و مصرف آن را برای رفع بیماریهای دستگاه تناسلی ادراری و تاخیر یا عدم قاعدگی مفید می دانند) 91 (. در طب سنتی سطح جهان و بخصوص ایران گیاه کلپوره دارای خاصیت ضد دیابتی آنتی اکسیدانی ضد اسپاسم و ضد چربی می باشد و در درمان یرقان التهاب ضد فشار خون ضد درد بی اشتهایی اختالالت کبدی و ورم مفصل مورد استفاده قرار میگیرد) 91 و 97 (.و بیش از 7111 سال است که در درمان درد شکم سو هاضمه در خاورمیانه استفاده می شود) 99 (.این گیاه دارای خاصیت آنتی موتاژنیک نیز می باشد) 98 (.و نیز در طب سنتی از این گیاه به عنوان ضد تهوع استفراغ ضد نفخ و نیز در درمان زخم معده مورد استفاده قرار میگیرید) 95 (. با توجه به رشد گیاه لگجی و کلپوره در ایران ونقش گیاه لگجی و کلپوره در درمان سرطان و دیابت و ارتباط بین پروتئین Sirt3 در میتوکندری با دیابت و سرطان و دیگر نقش های کلیدی این پروتئین در اعمال میتوکندری و ارتباط آن با افزایش طول عمر انسان برآن شدیم که اثر این دو گیاه را بر پروتئین کلیدی Sirt3 و تغییرات دیگر در میتوکندری از جمله تغییر در میزان گونه های فعال اکسیژن( ROS ) را بررسی کنیم. ب- کلیات ب- 1. سرطان کولون در ایاالت متحده ساالنه تقریبا موارد جدید سرطان های روده بزرگ تشخیص داده می شوند که مورد سرطان کولون هستند و باقیمانده سرطان های رکتوم می باشند. تقریبا آمریکایی هر ساله از سرطان های روده بزرگ می میرند) 96 (. این سرطان دومین سرطان مهم منجر به مرگ در هر دو جنسیت در ایاالت متحده میباشد) 92 (. سلول های سالم تحت کنترل شدید بیوشیمیایی برای رشد و تمایز می باشند. تقسیم سلولی و تکثیر تحت تاثیر محرک های رشد گوناگونی قرار دارند و توقف رشد و مرگ سلولی برنامه ریزی شده )آپوپتوز( تحت کنترل می باشند. در سرطان این فرآیند های تنظیمی مختل شده و سلول ها به طور کنترل نشده ای رشد کرده و تقسیم می شوند. انرژی سلول ها تحلیل رفته و بدلیل ناتوانی در تمایز ساختار و عملکردشان از بین می رود) 98 (.

18 3 در شرایطی که سلولهای طبیعی تغییر ماهیت داده میزان رشد آنها از کنترل خارج می شود و به صورت خودمختار و بدون وقفه رشد و گسترش پیدا می کنند. بدین ترتیب نظم و ساختار بافت طبیعی و عضو را بهم می زنند. رشد بی وقفه موجب ایجاد تومور و انتشار آن به نواحی نزدیک و دور دست به صورت متاستاز می شود) 93 (. 9 هستند یعنی با یک نوع سلول آغاز می شوند. معموال سال ها می گذرد تا سرطان بیشتر سرطان ها از لحاظ منشاء مونوکلونال خودش را نشان دهد چراکه 9 تا 2 جهش الزم است تا یک سلول توده بدخیم تشکیل دهد) 81 (. سرطان کولون با پولیپ های 8 آغاز می شود. این ساختارهای قارچ شکل عموما خوش خیم هستند اما گاهی با گذر زمان به سوی سرطانی شدن می آدنوماتوز روند) 81 (. علل سرطان بسیار زیاد و گوناگون است مانند مواد شیمیایی عوامل محیطی ویروس ها و عوامل موتاژن اما همه در نهایت منجر 5 که زندگی نرمال سلول را کنترل می کنند می شوند. وقتی این ژن ها جهش یابند به یک اختالل در بیان پروتوانکوژن ها تبدیل به انکوژن ها می شوند و به طور مداوم در یک فرآیند چندمرحله ای سرطان ایجاد می کنند) 87 (. 6 ژن های دخیل در ایجاد تومور کولورکتال شامل انکوژن ها ژن های بازدارنده تومور و ژن های MMR می باشند) 96 (. پروتوانکوژن ها ژن هایی طبیعی هستند که عملکردهای فوق العاده مهمی نظیر کنترل پیشرفت چرخه سلولی تکثیر سلولی و ممانعت از مرگ برنامه ریزی شده سلولی )PCD( القای فعالیت تلومراز افزایش ذخیره خونی را عهده دار هستند. هر تغییری در پروتوانکوژن ها )ژن های پیش سرطان زا( که باعث اختالل در روند طبیعی فعالیت آن ها شود مثال فعالیت آن ها را افزایش یا کاهش دهد سبب تبدیل پروتوانکوژن به ژن سرطان زا یا انکوژن می شود که فعالیت آن باعث سوق دادن یک سلول طبیعی به سمت غیرطبیعی شدن و در واقع سرطانی شدن می گردد) 89 (. انکوژن های دخیل در سرطان کولورکتال بسیار هستند که مهم ترین آنها ras های رشد می باشد) 96 (. و BCL-2 می باشد و این ژن ها تنظیم کننده P53 که یکی از مهم ترین ژن های بازدارنده است در بسیاری از فعالیت های سلولی مثل ترمیم DNA مرگ سلولی و... نقش 2 شده است. در هنگام بروز آسیب DNA در وهله اول P53 سعی می زیادی دارد. در %51 سرطان ها P53 دچار موتاسیون کند DNA را ترمیم کند. اگر ترمیم پذیر نباشد موجب القای آپوپتوز در آن سلول می شود. اگر این عمل انجام نشود جهش 3 Monoclonal 4 Adenomatous polyps 5 proto-oncogenes 6 mismatch repair genes 7 Mutation

19 8 ایجاد شده پایدار می گردد) 89 (. ژن های بازدارنده ی تومور که در سرطان کولورکتال دچار جهش و یا حذف می شوند شامل بر روی کروموزوم 5q ژن p53 می باشند) 96 (. ژن 8 APC 9 ب- 2. ژن های تعديل کننده چندین ژن دیگر نیز در ایجاد سرطان کولون مهم می باشند. اگرچه نقش و مکانیسم واقعی تومورزایی آنها هنوز به طور کامل شامل NSAIDs ها دارای اثرات مشخص نشده است. این ژن ها شامل cox-2 و PPAR می باشند. مهار کننده های 11 cox جلوگیری کننده از سرطان کولورکتال می باشند. ژن 11 PPAR در سرطان کولورکتال نقش دارد. این ژن یک دسته از رسپتورهای هسته ای را کد می کند که این رسپتورها به عنوان تنظیم کننده های رونویسی برای پروتئین های کنترل کننده ی متابولیسم لیپید و رشد سلولی می باشند. فعال شدن این رسپتور سبب مهار رشد و شروع تمایز سلولی می شود. شواهدی وجود دارد که نشان می دهد جهش و یا فقدان عملکرد ژن های PPAR می تواند مسئول ایجاد سرطان کولورکتال باشد) 96 (. گسترش و ایجاد سرطان کولون سال ها طول می کشد و تشخیص زودهنگام آن احتمال درمان قطعی را قویا باال می برد. بر طبق پیش بینی انجمن ملی سرطان وابسته به انستیتو پزشکی در سال 7119 کوچکترین تالش ها در جهت غربالگری سرطان کولون موجب کاهش 73 درصدی مرگ های ناشی از سرطان در 71 سال آینده خواهد شد) 88 (. 17 بهترین راه های غربالگری شامل تست خون مخفی در مدفوع و سیگموییدوسکوپی 19 و کولونوسکوپی می باشد. مزیت کولونوسکوپی بر سیگموییدوسکوپی این است که می تواند پولیپ ها را فورا جدا و از بافت نمونه گیری کند) 88 (. ب- 3. میتوکندری میتوکندری نیروگاه تولید انرژی در سلول است. این اندامک انرژی شیمیایی موجود در مواد غذایی را با عمل فسفوریالسیون اکسیداتیو به صورت پیوندهای پرانرژی فسفات (ATP) ذخیره می نماید. میتوکندری در تمام سلول های دارای تنفس هوازی به جز در باکتری ها که آنزیم های تنفسی آن ها در غشای سیتوپالسمی جایگزین شده اند وجود دارد. نام»میتوک ندری«ترکیبی است از دو واژه ی یونانی Mito به معنای رشته و chondrion به معنی دانه است چرا که این اندامک اغلب رشته ای یا به صورت دانه های کوچک در سیتوپالسم همه ی سلول های یوکاریوتی وجود دارد )85(. 8 Adenomatous polyposis coli gene 9 modifier genes 10 cyclo oxygenase 11 Peroxisome proliferator-activating receptor gene 12 Sigmoidoscopy 13 Colonoscopy

20 9 ب خصوصیات ظاهری میتوکندری و تغییرات آن ها مورفولوژی میتوکندری بین انواع مختلف سلول متفاوت است ( در سلول انفرادی و در محیط های مختلف سلولی(. میتوکندری در شرایط فیزیولوژیک طبیعی تحت شکافت و همجوشی با یکدیگر کشیده یا کوتاه میشوند و یا همچنین در اثر تحریک آسیب می بیند. میتوکندری ها در برخی مراحل عمل خود می توانند به شکل های دیگری درآیند. اما بعد از مدتی تمام این تغییرات اول حالت به برمی گردد. مطالعات آزمایشگاهی میتوکندری که دهد می نشان از مختلفی اشکال به عصبی های سلول جمله:کروی رشته ای ودایره مانند)میان تهی( وجود دارد. مورفولوژی میتوکندری نه تنها برای تنظیم حفظ سالمت سلول های طبیعی مهم است در آسیب میتوکندریایی و سلولی مرگ و بیماری نیز نقش دارد. میتوکندری ها در سلول هایی که هم نوع هستند یا اعمال مشترک دارند معموال اندازه ی ثابتی دارند )85(. ب غشا میتوکندری همانطور که در شکل 1 مشاهده می کنید غشای میتوکندری از نوع غشاهای زیستی می باشد. میتوکندریی یک اندامک دو غشایی است که غشا خارجی از نوع صاف و فاقد ریبوزوم است اما گاهی توسط شبکه ی آندوپالسمی احاطه می شود اما هیچ پیوستگی بین این دو دیده نمی شود.غشا داخلی میتوکندری دارای چین خوردگی های فراوانی است و محیطی را در فضای داخلی میتوکندری ایجاد می کند که به آن ماتریکس می گویند. درون ماتریکس آنزیم ها و پروتئین ضروری برای کارکرد صحیح میتوکندری و سلول وجود دارد. ب فضای بین دو غشا اتاق خارجی به فضای زیر غشای خارجی گفته می شود که شامل دو بخش فضای بین دو غشا و فضای دورن کریستاها می باشد. در بعضی جاها غشای داخلی و خارجی به یکدیگر چسبیده اند. در این ناحیه تراکمی از ریبوزوم های سیتوپالسمی دیده می شود. به نظر می رسد که این ناحیه محل عبور پروتئین ها از سیتوزول به میتوکندری باشد. ترکیبات این اتاق آب یون ها پروتئین ها قند چربی ATPو O2 SO2 ADP می باشد. ب :غشا داخلی میتوکندری غشای داخلی دارای ضخامتی های زیادی دارد که به منظم قرار گرفته اند. مشابه غشای خارجی است ولی ترکیب شیمیایی آن با غشا خارجی متفاوت است وچین خوردگی این چین ها کریستا گفته می شود این کریستاها در سلول های گیاهی نامنظم اما در سلول های جانوری